Phương pháp phổ khả kiến

 UV- visible spectrophotometry

Đo quang phổ là gì?

Mỗi hợp chất hóa học điều có tính hấp thụ, truyền, hoặc phản xạ ánh sáng truyền tới nó trên một phạm vi nhất định của bước sóng. Đo quang phổ là phương pháp định lượng chất hấp thụ hoặc truyền ánh sáng bằng cách đo cường độ ánh sáng khi chùm tia ánh sáng truyền qua dung dịch mẫu dựa trên nguyên lý sự hấp thụ chọn lọc bước sóng của dung dịch.

Quang phổ kế là một dụng cụ đo lượng photon (cường độ ánh sáng) hấp thụ sau khi nó đi qua dung dịch mẫu. Tùy thuộc vào phạm vi bước sóng của nguồn sáng  máy đo quang phổ được chia làm hai loại khác nhau:

-   Máy quang phổ có thể nhìn thấy UV: sử dụng dãy ánh sáng trên dãy cực tím (185 – 400 nm) và dãy quang phổ điện từ (400 – 700 nm) có thể nhìn thấy được.

-   Máy quang phổ IR: sử dụng dãy ánh sáng trên dãy hồng ngoại (700 – 15000 nm) của phổ bức xạ điện từ.

Hầu hết các máy quang phổ ngày nay điều sử dụng vùng ánh sáng UV.

Máy đo quang phổ UV

Khi nguyên tử ở trạng thái hơi tự do, nếu ta chiếu một chùm tia sáng có những bước sóng xác định vào đám hơi nguyên tử đó, thì các nguyên tử tự do đó sẽ hấp thụ các bức xạ có bước sóng nhất định ứng đúng với những tia bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ của nó, được gọi là quá trình hấp thụ năng lượng của nguyên tử tự do. Ứng với mỗi giá trị năng lượng ΔE mà nguyên tử đã hấp thụ ta sẽ có một vạch phổ hấp thụ với độ dài sóng đi đặc trưng cho quá trình đó, nghĩa là phổ hấp thụ của nguyên tử cũng là phổ vạch. Nhưng nguyên tử không hấp thụ tất cả các bức xạ mà nó có thể phát ra được trong quá trình phát xạ.

Ứng dụng định luật Lambert – Beer:

Hình ảnh định luật hấp thụ Beer–Lambert của chùm tia 

Khi chùm sáng có cường độ Io truyền tới môi trường có bề dày d thì bị hấp thụ một phần nên cường đố ánh sáng ra khỏi môi trường là I < Io. Nếu Io nhỏ và các hiện tượng phản xạ, tán xạ không đáng kể thì :

I = Ioexp(-α .C.d)

Độ truyền qua:          T= I/I0

Độ hấp thụ:               A = - logT = log 10e. (α .C.d )= 0, 434. (α .C.d)

Trong đó:

C là nồng độ của dùng dịch (mol/l hoặc %)

d là bề dày của lớp dung dịch (cm)

α là hệ số hấp thụ đặc trưng cho cấu tạo của chất tan trong dung dịch phụ thuộc bước sóng ánh sáng đơn sắc.

Hình ảnh nguyên lý hoạt động phương pháp quang phổ UV 1 tia

Hình ảnh nguyên lý hoạt động phương pháp quang phổ UV 2 tia

Nguồn sáng (Light source)

Nguồn sáng có nhiệm vụ cung cấp bức xạ tương thích với quá trình đo, bức xạ được cung cấp bới nguồn sáng thường là các bức xạ đa sắc, nó bao trùm một khoảng rộng của phổ.

Nguồn sáng phải ổn định trong khoảng thời gian đo, cường độ bức xạ được phát ra không được dao động. Ngoài ra, nguồn bức xạ không nên thay đổi đột ngột trong phạm vi bước sóng của nó.

Đèn Deuterium

Hình ảnh bóng dèn Deuterium

Hình ảnh mô tả nguyên lý hoạt động đèn Deuterium

Đèn deuterium gồm hai điện cực là Anode và Cathode được chết tạo từ cấu trúc hợp kim niken để tạo ra phổ ánh sáng tôt nhất, và một dây tóc bằng volfram (filament) đặt trên cực âm (Cathode) của đèn. Bên trong đèn được bơm đầy khí hydro.

Giữa Anode và Cathode được cung cấp một điện áp khá lớn khoản 300V đến 500V tạo ra một cường độ điện trường lớn. Dây tóc giữ nhiệm vụ đốt nóng giải phóng các electron, các ion này thu được động năng rất lớn và khi chúng va chạm với các phân tử khí sẽ làm ion hóa các phân tử khí và phát ra ánh sáng. Sau mỗi va chạm lại xuất hiện thêm một electron nữa (cùng với một ion dương), hai electron này thu được động năng lớn lại tiếp tục làm ion hóa các phân tử khác và tiếp tục phát sáng.

Đèn Deuterium cung cấp ánh sáng mạnh và ổn định trong vùng UV có bước sóng từ 160 – 400 nm. Trong các loại máy quang phổ kỹ thuật cao ngày nay thường được trang bị loài đèn này, thiết kế đặt biệt của nó giúp tăng tối đa tuổi thọ của đèn mà không làm giảm hiệu xuất của thiết bị. 

Công nghệ phát xung được áp dụng giúp cho đèn dể dàng chuyển sang trạng thái năng lượng thấp, điều này làm tăng tuổi thọ của đèn gấp 3 lần so với các đèn thông thường.

Đèn halogen tungsten

Đèn halogen tungsten là một bóng đèn sợi đốt bao gồm một dây tóc tungsten được bọc kín trong một bóng đèn nhỏ gọn với một hỗn hợp của một khí trơ và một lượng nhỏ khí halogen. Đèn halogen có thể hoạt động ở nhiệt độ, công suất và tuổi thọ cao hơn.

Màu sắc của ánh sáng phụ thuộc vào cấu trúc nguyên tử của khí được sử dụng bên trong, khí halogen cho ánh sáng trắng hơn không khác với ánh sáng tự nhiên (ánh sáng mặt trời). Do đó ánh sáng này có hiệu suất chiếu sáng cao hơn, kích thước bóng nhỏ hơn cho phép sử dụng nó trong các hệ thống quang học nhỏ như máy đo quang phổ,…

 Đèn Tungsen cung cấp ánh sáng ổn định. Có bước sóng từ 320 nm – 1100 nm.

Biểu đồ so sánh 2 vùng bước sóng của đèn Tungsten và Deuterium

Cả hai đèn Deuterium và Tungsten đều được yêu cầu để bao phủ toàn bộ dải bước sóng từ 190 nm đến 1100 nm.

Đèn tungsten là một nguồn sáng phổ biến nhất trong các thiết bị quang phổ, thời gian sử dụng khoảng 1200 giờ.

Flash xenon

Đèn flash bao gồm một ống thủy tinh kín, được làm đầy với xenon và các điện cực nhô ra vào mỗi đầu của ống.

Hình ảnh mô tả nguyên lý cấu tạo cơ bản bóng Flash xenon

Nguyên lý hoạt động cơ bản đèn Flash xenon

Tụ C1 là điện tích qua điện trở R2. Khi SW1 được nhấn C1 xả nhanh, mặc dù T2 tạo ra xung điện áp cao làm ion hóa khí trong ống, khiến cho C3 xả qua ống, do đó sẽ tạo ra một tia sáng.

Tụ điện C3 1 loại tụ photoflash đặc biệt chúng có thể chịu được tốc độ xả cao, chiệu được điện áp cao lên đến 500V.

Đèn flash Xenon tạo ra xung ánh sáng nhấp nháy khoản 80 lần/giây. Đèn này không cung cấp độ ổn định quang học của đèn deuterium / Tungsten, nhưng chúng cung cấp các đặc điểm phổ liên tục từ tia cực tím đến hồng ngoại để cung cấp ánh sáng nhân tạo gần với ánh sáng mặt trời tự nhiên nhất.

Người dùng cũng có thể điều chỉnh phổ đầu ra bằng cách chuyển đổi vật liệu cửa sổ hoặc thêm bộ lọc quang học.

Led (light-emitting diode)

Cấu tạo Led

Led là một diode nối tiếp p-n phát ra ánh sáng khi được kích hoạt. Các electron có thể tái kết hợp với các lỗ electron trong thiết bị, giải phóng năng lượng dưới dạng photon. Hiệu ứng này được gọi là phát quang điện, và màu của ánh sáng (tương ứng với năng lượng của photon) được xác định bởi khoảng cách dải năng lượng của chất bán dẫn.

Led được sử dụng cho các ứng dụng bước sóng đơn lẻ, đèn Led ổn định, chi phí thấp và tuổi thọ dài từ 1000 đến 2000 giờ.

Bộ tán sắc (Monochromator)

Đến với thành phần tiếp theo của quang phổ UV ta có thể nhìn thấy được đó là bộ tán sắc. Chức năng của chúng là tạo ra một chùm bức xạ đơn sắc, có nghĩa là 'bức xạ bước sóng đơn' có thể được chọn từ một loạt các bước sóng. 

Các thành phần thiết yếu của bộ đơn sắc là:

-         Khe vào (Entrance slit)

-         Bộ phân tách ánh sáng (Dispersion device)

-         Khe ra (Exit slit)

Bức xạ đa sắc (bức xạ có nhiều hơn một bước sóng) đi vào bộ tán sắc thông qua khe vào. Các chùm tia được tới đập vào bộ phận phân tách ánh sáng (thường dùng lăng kính hay bộ lọc ánh sáng) ở một góc. Các chùm tia tới được chia thành các bước sóng thành phần của nó bởi lăng kính (hay cách tử) và đi ra ở khe ra, tùy thuộc và nhu cầu sử dụng thì người ta chỉ cần lấy 1 bước sóng thông qua điều chỉnh khe ra.

Lăng kính (Prism)

            Lăng kính là một khối chất trong suốt (thủy tinh, nhựa, thạch anh ...) thường có dạng lăng trụ tam giác, những bức xạ có bước sóng khác nhau sẽ bị bẻ gãy thành những góc khác nhau khi đi ra khỏi lăng.

            Lăng kính được chia làm các loại sau:

-         Lăng kính tán xạ.

-         Lăng kính phản xạ.

-         Lăng kính phân cực.

Trong phép đo quang phổ người ta sử dụng lăng kính phân cực. Ánh sáng trắng sau khi đi qua lăng kính phân cực, ánh sáng trắng được tách ra thành các thành phần khác nhau của ánh sáng trắng.

Nguyên lý hoạt động lăng kính phân cực

Cách tử (Gratings)

Cách tử được cấu tạo với vô số những khe rất nhỏ cách điều nhau trên một điện tích bề mặt, khoảng 200 khe trên một mật độ rộng 1cm.

Cách tử được chia làm 2 loại là cách tử truyền xạ và cách tử phản xạ mỗi loại còn phân chia ra nhiều loại nhỏ khác…

Nguyên lý hai loại cách tử

Khi ánh sáng lang truyền qua cách tử sẽ xẩy ra hiện tượng tán xạ tạo ra những phổ tương tự như phổ tạo ra bởi lăng kính, tuy nhiên nó tạo ra được nhiều phổ và trải rộng hai bên. phổ trung tâm.

Tán xạ tạo ra nhiều phổ trải rộng hai bên phổ trung tâm

          Ngoài ra người ta còn dùng các loại kính lọc đơn sắc để tách lấy bước sóng cần thiết cho phép đo. 

Hệ thống kính lọc màu trên máy xét nghiệm sinh hóa VegaSys

           Cuvettes

Cuvette là một ống nhỏ có dạng tròn ống tròn hoặc ống vuông, được bịt kín đầu. Được cấu tạo từ vật liệu nhựa, thủy tinh, hoặc thạch anh đây là những vật liệu có thể cho ánh sáng truyền qua. Chúng được thiết kế để chứa các mẫu nước, dung dịch dùng cho máy quang phổ để định lượng hoặc xác định phổ và bước sóng của mẫu dung dịch. Cuvet được thiết kế dạng ống vuông, ống tròn hoặc ống hình chữ nhật.

Các dạng khác nhau của cuvette

Cuvectte gồm các loại sau:

-   Cuvet nhựa chỉ dùng 1 lần thường được sử dụng trong các xét nghiệm nhanh mà trong đó tốc độ là quan trọng hơn so với độ chính xác của phép đo.

-   Cuvet thủy tinh thường dùng trong phạm vi bước sóng của ánh sáng nhìn thấy.

-   Cuvette thạch anh có độ chính xác cao dùng cho cả bước sóng tia UV dải NIR.

Trong mỗi loại chất liệu cấu tạo nên cuvet thì độ chính xác của từng loại là khác nhau:

-   Với cuvet thủy tinh, dùng trong bước sóng từ 340-2500nm và nó truyền qua tới 80% độ dung sai là 1% tại bước sóng 350nm.

-   Cuvette nhựa được dùng cho bước sóng từ 380-780nm (vùng ánh sáng nhìn thấy).

Còn đối với thạch anh được chia ra các loại :

-   Thạch anh nung chảy dùng với bước sóng dưới 380 nm (vùng quang phổ cực tím).

-   Thạch anh UV hoạt động ở dải bước sóng từ 190-2500 nm với độ dung sai 1% ở 220 nm.

-   Thạch anh ES có khoảng bước sóng từ 190-2000 nm độ dung sai là 1% ở 220nm.

-   Thạch anh IR có khoảng bước sóng từ 220-3500 nm, độ dung sai cho phép 1& tại 2730nm.

           Đầu dò (Detecter)

Là bộ phận thu nhận ánh sáng sau khi đi qua dung dịch mẫu, hầu hết các Detecter sử dụng hiệu ứng quang điện tín hiệu quang học sẽ được thu nhận và chuyển thành tín hiệu điện dòng điện tỷ lệ thuận với cường độ ánh sáng.

Yêu cầu kỹ thuật của bộ Detecter:

-   Có độ nhạy cao để thu được những bức xạ có năng lượng thấp.

-   Đáp ứng tần số cao.

-   Sự ổn định lâu dài.

-   Tín hiệu điện của detecter dể khuếch đại bởi bất kỳ bộ khuyết đại nào.

Các loại detecter thường dùng:

-   Bộ ghép và nhân quang (Photomultiplier) hình 2.21.

-   Photodiode: hay còn gọi là diode quang là một loại diode bán dẫn chuyển đổi năng lượng photon thành tín hiệu điện theo hiệu ứng quang điện. 

Một số dạng Photodiode cua hãng HAMAMATSU

Máy quang phổ chùm đơn: máy quang phổ 1 chùm tia phải đo 2 lần, 1 lần với mẫu chuẩn (chỉ chứa dung môi) và 1 lần với mẫu cần đo (chứa dung dịch cần phân tích) -> I0 trong 2 lần đo phải không đổi -> kết quả phân tích không chính xác.

Máy quang phổ chùm đôi: máy quang phổ 2 chùm tia thì ánh sáng tới được tách làm 2 chùm : 1 đi qua mẫu chuẩn (Reference) và 1 lần đi qua mẫu cần đo, sau đó cùng đi vào đầu thu để so sánh cường độ -> chỉ phải đo 1 lần -> kết quả phân tích chính xác và tính được ngay độ hấp thụ A.

Ứng đụng phương pháp đo quang phổ trong lĩnh vực y học

Phân tích Vitamin A và phẩm nhuộm màu trên dây chuyền sản xuất trong công nghiệp Dược.

Xác định protein tổng có trong nước tiểu.

Phân tích tế bào máu.

Phân tích DNA/RNA, protein.

Phân tích dược phẩm, nông dược,…